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純化的RNA的點雜交和狹線雜交
更新時間:2016-02-22   點擊次數(shù):993次

1) 純化的RNA的點雜交和狹線雜交 

安裝印跡裝置 

1.切一張合適大小的帶正電荷尼龍膜。用鉛筆標(biāo)上表示方向的記號。用水把膜簡單弄濕,在20×SSC中室溫泡1 h。 ELISA試劑盒

2.在膜浸泡期間,先用0.1 mol/L NaOH小心清洗印跡裝置,再用無菌水洗干凈。 

3.把兩片厚濾紙用20×SSC浸濕,再放到真空器頂部。 

4.把樣品槽插入裝置的上部,把濕尼龍膜放在樣品槽加樣孔的底部,用吸管在膜的表面滾動以去除膜與裝置夾層中的氣泡。 

5.加緊夾板,連接真空管。 

6.加入10×SSC直至液面沒過尼龍膜,關(guān)掉真空,再用10×SSC充滿。 

RNA樣品準(zhǔn)備 

1.把每個RNA樣品(溶解在10μl水)分別與30μl RNA變性液混合。 

2.65℃溫育5 min,然后在冰上冷卻。 

3.向每個樣品中加入等體積20×SSC。 

4.輕輕向印跡裝置中吸入 10×SSC,直到淹沒尼龍膜。 

RNA樣品的印跡和RNA在膜上的固定 

1.把所有樣品輕輕加入狹線中,然后輕輕吸干膜。當(dāng)所有樣品都鋪到膜上后,每個狹線用1 ml 10×SSC洗兩次。 

2.當(dāng)?shù)诙蜗茨ね瓿珊?,繼續(xù)輕輕吸干膜。 

3.取下膜,用紫外交聯(lián)、烘烤或微波照射把RNA固定在膜上。 

固定化RNA的雜交與洗膜 

1.把膜放入烤盤或雜交爐中,加入10~20 ml預(yù)雜交液68℃溫育2 h。ELISA試劑盒 

2.把已變性的放射性標(biāo)記的探針直接加到預(yù)雜交液中。在適當(dāng)?shù)臏囟认吕^續(xù)溫育12~16 h。 

3.雜交完后從塑料袋中取出膜,然后盡可能快地把膜轉(zhuǎn)移到室溫下裝有100~200 ml、1×SSC(0.1% SDS)的塑料容器中。蓋緊塑料容器,放到搖床上輕搖10 min。 

4.把膜轉(zhuǎn)移到另一個裝有100~200 ml、預(yù)熱到68℃的0.5×SSC(含0.1% SDS)的塑料袋中,然后在此溫度下輕搖10 min。 

5.按步驟17重復(fù)洗膜兩次,使總的洗膜次數(shù)達(dá)到三次。 

6.用濾紙吸干膜,在-70℃條件下放射自顯影 24~48 h(Kodak XAR-5 或相當(dāng)?shù)哪z片)。鎢酸鹽型的增感屏比舊式稀土型的效果更好。當(dāng)然,磷光成像儀也可以用來成像。 

2)RNA 斑點印跡的制備

1.裁一張大小合適的濾膜,用軟鉛筆標(biāo)記RNA加樣的位置,一個cm的方格即可。

2.以20×SSC浸泡濾膜。 

3.在65℃用以下溶液溫育5min,使10~20μg的總RNA變性。

>總RNA(10~20μg) 2.0μl

變性液 6.0μl

置冰浴快速冷卻5min,用微量離心管離心片刻以回收液滴,將管置于冰浴。

4.將濾膜鋪在一疊經(jīng)20×SSC浸泡過的濾紙(如Whatman 3MM)上。 

5.在膜上點樣,每孔 4μl RNA,待一孔干燥后再加另一孔。 

6.將濾膜置濾紙(3MM)上稍微晾干,用20×SSC漂洗片刻。ELISA試劑盒 

7.當(dāng)濾膜仍潮濕時,將濾膜RNA面朝下在紫外線透照儀照射3~5min,使RNA固定于濾膜上,此濾膜已可用于雜交。

 

 

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