免疫熒光是標(biāo)記免疫技術(shù)發(fā)展zui早的一種,它是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項(xiàng)技術(shù),通過將抗體與一些示蹤物質(zhì)結(jié)合,利用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行組織或細(xì)胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位。免疫熒光步驟包括,細(xì)胞固定和通透,封閉,孵育一抗,二抗等。除了這些基本步驟,以下建議可以幫助您獲得更好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
1、細(xì)胞固定和通透
為達(dá)到的檢測效果,細(xì)胞需要經(jīng)過固定和通透。這些步驟非常關(guān)鍵,細(xì)胞和抗原需要保證的結(jié)構(gòu),并利于抗體與抗原結(jié)合。通常情況下,需要通過以下步驟得以實(shí)現(xiàn):細(xì)胞用2%-4%多聚甲醛固定,之后用0.1%皂角苷或0.02%的Triton X-100進(jìn)行通透。前者是比較溫柔的處理,但是對(duì)于核內(nèi)抗原可能無效,需要用到Triton。使用皂角苷進(jìn)行通透時(shí),要注意它會(huì)引起細(xì)胞膜的可逆性通透,也就是除了在通透初期,在每個(gè)抗體孵育環(huán)節(jié)都需要進(jìn)行通透。另外,細(xì)胞可以用冰甲醇進(jìn)行同時(shí)固定和通透,可以避免去垢劑的使用。
2、抗體特異性
免疫熒光需要用到特異性非常強(qiáng)的抗體,可以避免高背景和不理想的蛋白定位結(jié)果。在大多數(shù)情況下,純化抗體的效果很好,但是正確的對(duì)照可以幫助定位抗原。使用只有二抗染色的片子作為陰性對(duì)照,有利于減少降低背景干擾。
3、合適的抗體稀釋比例
通過優(yōu)化抗體稀釋比例來優(yōu)化染色,通常情況下1ug/ml的純化抗體或者1:100-1:1000的抗血清足夠達(dá)到特異性染色的結(jié)果。但在能保證低背景染色的前提下,可以通過增加濃度來提高信號(hào)強(qiáng)度。如果是*次使用該抗體或測定某抗原,強(qiáng)烈建議濃度梯度實(shí)驗(yàn)。
4、優(yōu)化緩沖液和封閉劑
盡管很多抗原在常見的Buffer如PBS中可以很好的被染色,但是對(duì)于某些目的抗原,更換一下含有不同離子的緩沖液,比如鈣、鎂、鉀等,可以帶來很大程度上的改善。Rockland可提供優(yōu)化過的IHC用封閉緩沖液,同樣適用于熒光染色實(shí)驗(yàn)。
5、選擇正確的二抗
如果您需要做免疫實(shí)驗(yàn),我們強(qiáng)烈建議您選擇進(jìn)行過預(yù)吸附的二抗進(jìn)行單染實(shí)驗(yàn);如果是雙重甚至是多重染色,那么必須使用預(yù)吸附的二抗。同時(shí),請(qǐng)優(yōu)先選擇來自同一物種的二抗。
6、使用合適的細(xì)胞密度
選擇合適的細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行染色,當(dāng)細(xì)胞數(shù)量過多時(shí),細(xì)胞結(jié)構(gòu)不好,導(dǎo)致染色背景深,低細(xì)胞密度,會(huì)使細(xì)胞貼壁不佳,狀態(tài)不好。
7、多重染色
對(duì)同一樣本進(jìn)行兩個(gè)不同抗原的檢測時(shí),可以用各自的抗體進(jìn)行同時(shí)染色,但要求兩個(gè)一抗的種屬來源不同,標(biāo)記物不同,而二抗的種屬來源需保持一致。
8、降低背景
高背景是免疫熒光常見的問題,解決此問題可以用二抗來源的正常血清代替BSA做封閉液,降低抗體濃度,增加洗滌次數(shù),洗滌至少三次,每次五分鐘,推薦洗滌液為PBS+0.05%Tween。
9、封片
作為免疫熒光的zui后一步,可以提高折射率,保護(hù)樣品。
10、數(shù)據(jù)分析
觀察整體樣片時(shí),選擇具有代表性的細(xì)胞進(jìn)行數(shù)據(jù)獲取與分析。