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腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)基反復(fù)貼壁法和機(jī)械刮除法步驟
更新時間:2014-07-18   點擊次數(shù):1630次

腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)基反復(fù)貼壁法和機(jī)械刮除法步驟

    根據(jù)腫瘤細(xì)胞比成纖維細(xì)胞貼壁速度慢的特點,并結(jié)合使用不加血清的營養(yǎng)液,把含有兩類細(xì)胞的細(xì)胞懸液反復(fù)貼壁,使兩類細(xì)胞相互分離,操作方法與傳代相同。

 ?。?)待細(xì)胞生長達(dá)一定數(shù)量后,倒出舊培養(yǎng)液,用胰酶消化后,Hanks 沖洗2次,加入不含血清的培養(yǎng)液,吹打制成細(xì)胞懸液;

 ?。?)取編號為此A、B、C三個培養(yǎng)瓶;首先把懸液接種入A培養(yǎng)瓶中。置溫箱中靜止培養(yǎng)5~20分鐘后,輕輕傾斜培養(yǎng)瓶,讓液體集中瓶角后慢慢吸出全部培養(yǎng)基液,再接種入B培養(yǎng)瓶中后;向A瓶中補(bǔ)充少許*培養(yǎng)液置溫箱中繼續(xù)培養(yǎng);

 ?。?)培養(yǎng)B瓶中細(xì)胞5~20分鐘后,接處理A的方法,把培養(yǎng)液注入C培養(yǎng)瓶中;再向B瓶中補(bǔ)加*培養(yǎng)基。

  當(dāng)三個瓶內(nèi)都含有培養(yǎng)基液后,均在溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)。如操作成功,次日觀察可見A瓶主要為成纖維細(xì)胞,B瓶兩類細(xì)胞相雜,C瓶可能主要為癌細(xì)胞。必要時可反復(fù)處理多次,直至癌細(xì)胞純化為止。 

    是用不銹鋼絲末端插有橡膠刮頭(用膠塞剪成三角形插以不銹鋼絲)、或裹少許脫脂棉制成,裝入試管中高壓滅菌后備用(也可用特制電熱燒灼器刮除)。刮除程序為:

 ?。?)標(biāo)記:鏡下觀察,用不脫色筆在培養(yǎng)瓶皿的背面圈下生長腫瘤細(xì)胞的部位;

 ?。?)刮除:棄掉培養(yǎng)液,把無菌膠刮伸入瓶皿中,肉眼或顯微鏡窺視下,刮除無標(biāo)記空間;

 ?。?)用Hanks液沖洗一兩次,洗除被刮掉的細(xì)胞;

 ?。?)注入培養(yǎng)基液繼續(xù)培養(yǎng),如發(fā)現(xiàn)仍有成纖維細(xì)胞殘留,可重復(fù)刮除至*除掉為止。

 

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